Năm 1936, nhà khảo cổ học người Mỹ Indiana Jones đã dũng cảm dấn thân vào một ngôi đền cổ xưa chứa nhiều cạm bẫy chết người tại Peru nhằm tìm ra một pho tượng thần bằng vàng. Sau khi vượt qua hàng loạt thử thách cũng như bị những kẻ dẫn đường phản bội, anh liền đối mặt với đồng nghiệp đối địch của mình, nhà khảo cổ René Belloq và đám thổ dân người Jibito bản địa. Do bị chúng bao vây và áp đảo, Jones buộc phải trao pho tượng cho Belloq rồi nhân cơ hội trốn thoát bằng một chiếc thủy phi cơ đậu gần đó.

Không lâu sau, hai đặc vụ thuộc Cơ quan Tình báo đã có buổi gặp mặt riêng với Jones tại Đại học Marshall – nơi anh đang làm giảng viên; họ báo tin cho Jones rằng bọn Phát xít Đức đang làm việc cùng Abner Ravenwood, người thầy cũ mà anh từng theo học tại Đại học Chicago. Phát xít Đức biết rằng Ravenwood chính là chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực nghiên cứu về thành phố cổ đại Tanis ở Ai Cập, và ông này là người đang nắm giữ chiếc huy hiệu đính trên đầu cây "quyền trượng của thần Ra" – một di vật thuộc thời Ai Cập cổ đại. Jones đưa ra suy luận rằng bọn Phát xít đang tìm kiếm chiếc rương thánh vì tin rằng nó sẽ làm cho quân đội của chúng trở nên bất khả chiến bại. Cuối cùng hai đặc vụ ủy thác cho Jones nhiệm vụ tìm kiếm chiếc rương.

Jones đi đến Nepal để tìm manh mối thì phát hiện ra Ravenwood đã chết, còn mảnh huy hiệu thì nằm trong tay con gái ông là Marion. Jones ghé thăm quán rượu của Marion để xin mảnh huy hiệu nhưng bị cô từ chối, ngay sau đó cô gái này bị một nhóm côn đồ do sĩ quan của Phát xít Arnold Toht dẫn đầu tìm đến. Một trận đấu súng nổ ra, quán rượu bị đốt cháy còn huy hiệu bị bén lửa. Toht cố cầm lấy chiếc huy hiệu và bị bỏng tay, thế là y cắn răng trốn khỏi quán rượu. Jones và Marion giành lại được mảnh huy hiệu, rồi cô quyết định trở thành bạn đồng hành cùng Jones trong chuyến phiêu lưu của anh. Họ di chuyển đến Cairo, Ai Cập và gặp gỡ bạn của Jones là Sallah, một thợ đào lành nghề. Sallah báo tin với hai người rằng Belloq cùng bọn Phát xít đang đào bới tìm kiếm "Giếng Linh hồn" — nơi được cho là dẫn đến chỗ cất giấu chiếc rương, với một bản sao của mảnh huy hiệu được tạo nên từ vết sẹo trên tay Toht. Tiếp đó, Jones và Marion bị một nhóm lính Phát xít tấn công và Marion tưởng như đã chết bởi một vụ nổ trong cuộc truy đuổi. Sau khi giáp mặt với Belloq tại một quán rượu địa phương, Jones và Sallah tái hợp nhau rồi họ nhận ra mảnh huy hiệu của bọn Phát xít sở hữu chưa hoàn thiện cũng như nơi chúng đang đào bị sai chỗ, bởi chúng chỉ nắm được một phần thông tin liên quan đến vị trí của Giếng Linh hồn.

Jones và Sallah đã bí mật thâm nhập vào nơi Phát xít Đức đào xới. Tại đây Jones phát hiện Marion còn sống nhưng đang trong tình cảnh bị trói chặt và bịt miệng trong một túp lều; anh quyết định không cởi trói và giải thoát cho cô vì sợ đánh động bọn Phát xít, nhưng hứa sau đó sẽ trở lại cứu cô. Kế đó, Jones và Sallah cùng các cộng sự đã lần ra vị trí của Giếng Linh hồn và phát hiện trong đó toàn rắn độc. Họ chợt nảy ra ý tưởng xua đuổi bọn rắn bằng lửa và xăng rồi tiến đến chỗ quan tài đá đang cất giữ chiếc rương. Không lâu sau, Belloq, Toht cùng sĩ quan Phát xít Dietrich phát hiện ra hành tung của nhóm Jones và tiến hành bao vây chiếc giếng, đoạt lấy chiếc rương khỏi tay Jones cũng như nhốt anh và Marion vào trong hầm mộ. Cả hai nỗ lực thoát khỏi hầm mộ và tiến đến một phi trường địa phương, nơi Jones có màn đấu tay đôi với một tên thợ máy và giành chiến thắng, qua đó phá hủy chiếc phi cơ có thân cánh liền khối mà bọn Phát xít dùng để vận chuyển chiếc rương tới Berlin, Đức. Quân Quốc xã trong tâm trạng hoảng loạn đã đưa chiếc rương lên xe tải chạy trốn, nhưng Indy liền cưỡi ngựa truy đuổi đến cùng: anh cướp xe tải, đánh bại bọn Phát xít và thu xếp để vận chuyển chiếc rương đến Luân Đôn bằng tàu hơi nước có tên Bantu Wind.

Ngày kế tiếp, một con tàu U-boat của bọn Quốc xã chặn đường đi của Bantu Wind. Belloq, Toht và Dietrich đoạt lại chiếc rương và bắt giữ Marion, nhưng không tìm thấy Jones; sau đó nhà khảo cổ này bí mật nhảy lên chiếc tàu U-boat và theo chân kẻ thù đến biển Aegea. Khi đặt chân đến đó, Belloq định kiểm tra sức mạnh của chiếc rương trước khi đem trình bày nó trước Hitler. Jones sau đó đã tự hiện diện trước bọn Phát xít và đe dọa phá hủy chiếc rương bằng một khẩu súng chống tăng, nhưng Belloq nhận ra trò bịp của anh và buộc Jones phải đầu hàng.

Quân Quốc xã đưa Jones và Marion tới khu vực nơi chiếc rương sẽ được mở; chúng trói chặt họ vào một chiếc cột đứng để quan sát. Trong bộ trang phục Thượng tế của Israel, Belloq tiến hành nghi thức mở chiếc rương bằng lời gọi hồn của một người cầu nguyện Sabát, thế rồi chiếc rương mở ra chứa đầy cát bên trong – chúng có lẽ là những gì còn sót lại của Mười điều răn. Khi Jones cảnh báo Marion hãy nhắm chặt mắt lại, những linh hồn bay lên từ chiếc rương và sau đó dần lộ diện là những Thiên thần chết chóc. Kế đó những ngọn lửa dần hình thành phía trên chiếc rương bị mở, rồi chúng bắn ra hàng loạt tia năng lượng xuyên thủng bọn lính Quốc xã và giết chết tất cả chúng ngay tại chỗ. Dưới sức nóng khủng khiếp, Dietrich ngay lập tức bị biến thành cái xác ướp; tất cả da thịt của Toht bị tan chảy khỏi hộp sọ của y, còn đầu của Belloq thì nổ tung. Tiếp đó cả một bể lửa nhấn chìm và làm bốc hơi toàn bộ những người tận mắt chứng kiến vụ việc trong một cơn gió lốc, ngoại trừ Marion và Jones, trước khi nắp của chiếc rương tự đóng lại. Khi Jones và Marion mở mắt ra, họ thấy toàn bộ khu vực đã bị xóa sổ và đám dây trói họ cũng bị đốt cháy, cặp đôi vui mừng ôm nhau vì đã thoát nạn.

Trở lại Washington, D.C., các đặc vụ thuộc Cơ quan Tình báo nói với Jones và Marcus Brody rằng chính phủ Hoa Kỳ đã trả cho họ một khoản tiền hậu hĩnh vì đã bảo vệ toàn vẹn chiếc rương. Các đặc vụ cũng cho biết chiếc rương hiện đang nằm ở một nơi an toàn và được trang bị bảo vệ nghiêm ngặt, và nó sẽ được "những chuyên gia hàng đầu" tiến hành nghiên cứu và giám sát. Tiếp đó ở cảnh cuối phim, chiếc rương được niêm phong trong một thùng gỗ và được cất giữ trong một nhà kho chính phủ khổng lồ bên cạnh vô số các thùng khác (sau này ngụ ý nhà kho đó chính là Khu vực 51).